Глава 2

Физиология микроорганизмов (микробиология)

Для понимания процессов обмена веществ в клетке необходимо знать ее химический состав.

Бактериальная клетка состоит из органогенов - азота (8- 15% сухого остатка), углерода (45-55%), кислорода (30%), водорода (6-8%). Из них и других элементов и соединений микроорганизмы синтезируют белки, нуклеопротеиды, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты, ферменты, витамины и пр.

75-85% приходится на долю воды. В спорах бацилл и клостридий концентрация воды 40-50 %, она главная составная часть клетки, находится в связанном состоянии, т. е. структурный элемент цитоплазмы - свободная вода, которая является растворителем для кристаллических веществ, источником водородных ионов и участником химических реакций.

Минеральные вещества бактерий - это неорганические компоненты (фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, сера, натрий участвует в поддержании осмотического давления в клетке, магний, калий, кальций, железо ферментов АТФ - аккумулятор энергии в клетке, хлор и др.), микроэлементы в дыхательных ферментах (молибден, кобальт, бор), которые участвуют в синтезе, активизируют их, марганец, цинк, медь и др.

50-80% сухого вещества бактериальной клетки приходится на долю белка. Он распределен в цитоплазме, нуклеоиде, цитоплазматической мембране и других клеточных структурах. К белкам принадлежат ферменты, многие токсины.

Большое значение в жизнедеятельности клетки имеют нуклеопротеиды - соединение белка с нуклеиновыми кислотами ДНК и РНК. Кроме нуклеопротеидов в клетке находятся липопротеиды, гликопротеины, хромопротеины.

ДНК - аденин, гуанин, цитозин, тимин, фосфорная кислота и дезоксирибоза.

РНК - аденин, гуанин, цитозин, урацил, фосфорная кислота, рибоза.

Количественное и качественное разнообразие белковых веществ, их комплексов и аминокислот наделяет мембраны видовой специфичностью.

Нуклеиновые кислоты ДНК содержатся в нуклеоиде и обусловливают генетические свойства, РНК - биосинтез белка.

Углеводы - 12-18% сухого вещества. Это основнойис-точник энергии и углерода.

Многие структурные компоненты клетки состоят из углеводов (оболочка, капсула, слизистый слой). У ряда бактерий в цитоплазме имеются включения, по своему составу напоминающие гликоген, крахмал; играют роль запасных веществ в клетке.

Липиды - составляют ~ 10% сухого остатка. У бактерий, откладывающих жир в виде особых включений, количество липидов доходит до 40% (микобактерии туберкулеза).

Липиды - это запасные вещества, повышающие устойчивость бактерий во внешней среде. Связываясь с белками и углеводами, липиды составляют сложный комплекс, определяющий токсические свойства микроорганизмов.

Жизненные функции микроорганизмов: питание, дыхание, рост и размножение - изучает физиология. В основе физиологических функций лежит непрерывный обмен веществ (метаболизм). Сущность обмена веществ составляют два противоположных, но взаимосвязанных процесса: ассимиляция (анаболизм) и диссимиляция (катаболизм).

Ассимиляция - это усвоение питательных веществ и использование их для синтеза клеточных структур.

При процессах диссимиляции питательные вещества разлагаются и окисляются, при этом выделяется энергия, необходимая для жизни микробной клетки. Все процессы синтеза и распада питательных веществ совершаются с участием ферментов. В микроорганизмах происходит интенсивный обмен веществ, за сутки 1 микробная клетка может переработать питательных веществ, которые в 30-40 раз больше ее массы.

Микробная клетка использует питательные субстраты для синтеза составных частей своего тела, ферментов, пигментов роста.

§ 3. Ферментативная активность бактерий

Ферменты - биологические катализаторы, высокомолекулярные вещества белковой природы, вырабатываемые живой клеткой. Они строго специфичны и играют важнейшую роль в обмене веществ микроорганизмов. Специфичность их связана с активными центрами, образуемыми группой аминокислот, т. е. каждый фермент реагирует с определенным химическим соединением или катализирует одну или несколько близких химических реакций. Например: фермент лактаза расщепляет лактозу, мальтаза - мальтозу и т. д.

Экзоферменты - выделяясь во внешнюю ере- Эндоферменты - участ-ду, расщепляют макромолекулы питательных Вуют в реакциях обмена веществ до более простых соединений, которые могут быть усвоены микробной клеткой (экзоферменты гидролиза вызывают гидролиз жиров, белков, углеводов).

Ферментный состав микроорганизмов является постоянным, а различные виды микробов четко различаются по набору ферментов. Поэтому изучение ферментативного состава имеет важное значение для идентификации различных микроорганизмов.

Практическое использование ферментативных свойств микробов: процессы брожения, грибы в пивоварении и виноделии, обработка шкур, для смягчения; консервирование. Приготовление биодобавок к стиральным порошкам, для удаления белковых загрязнений, так как они расщепляют белки до водорастворимых.

С помощью ферментов получают витамины, гормоны, алкалозы.

веществ, происходящих внутри клетки.

§ 7. Практическая часть

Приготовление сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюлях. Лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Большие количества среды (десятки и сотни литров) готовят в специальных варочных котлах или реакторах. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 мин в 1-2% растворе хлороводородной кислоты или погружают в этот раствор на ночь, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде. (Посудой, предназначенной для приготовления сред, нельзя пользоваться в других целях, например для хранения химических реактивов или дезинфицирующих растворов - даже следы этих веществ могут помещать росту микроорганизмов.)

Исходным сырьем для приготовления большинства сред служат продукты животного или растительного происхождения: мясо и его заменители, молоко, яйца, картофель, соя, кукуруза, дрожжи и др.

Основные питательные бульоны готовят на мясной воде или на различных переварах, полученных при кислотном или ферментативном гидролизе исходного сырья. Бульоны из переваров в 5-10 раз экономичнее, чем из мясной воды. Среды на переварах богаче аминокислотами, следовательно, питательнее; обладают большей буферностью, т. е. имеют более стабильную величину рН. Кроме того, препараты можно готовить из заменителей мяса (сгустков крови, плаценты, казеина и т. д.).

В настоящее время снабжение лабораторий мясной водой и переварами централизовано. Чаще пользуются панкреатическим переваром Хоттингера, гидролизатами казеина или кормовых дрожжей. Из этих полуфабрикатов, по определенным рецептам, готовят необходимые среды.

Этапы приготовления сред: 1) варка; 2) установление оптимальной величины рН; 3) осветление; 4) фильтрация; 5) разлив; 6) стерилизация; 7) контроль.

Варят среды на открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах, подогреваемых паром.

Установление рН сред ориентировочно производят с помощью индикаторных бумажек. Для точного определения рН используют потенциометр.

Разливают среды в пробирки (по 3-5 мл или по 10 мл), флаконы, колбы, матрицы и бутылки не более чем на 23 емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.

Среды, которые стерилизуют при температуре выше 100°С, разливают в чистую сухую посуду. Среды, стерилизуемые при более низкой температуре, обязательно разли вают в стерильную посуду.

Разливают среды с помощью воронки, на конец которой* надета резиновая трубка с зажимом Мора. Для мерного разлива применяют мензурки, бюретки, дозаторы, шприцы-пипетки и т. п.

Посуду со средой обычно закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки. Важно, чтобы при разливе среда не смачивала края посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки. К каждому сосуду обязательно прикрепляют этикетку с названием среды и той ее приготовления.

Стерилизация. Режим стерилизации зависит от состава среды и указан в ее рецепте. Примерная схема режима сте-| рилизации сред приведена в таблице.

Режим стерилизации сред

Режим стерилизации |Ц

Температура, давление

Автоклав

120°С (1 атм)

Сложные: 1) с углеводами, молоком, желатином

Автоклавирование с закрытой крышкой или аппарат Коха

100°С (текучий пар)

30- 60 мин 3 дня подряд (дробная стерилизация)

2) белковые (сывороточные или яичные) с уплотнением

Свертыватель Коха (возможны два режима)

1 ч 3 дня подряд

1 ч однократно |

3) белковые, жидкие

Водяная баня или инактиватор

1 ч 3 - 4 дня подряд Ш

Контроль готовых сред: а) для контроля стерильности среды ставят в термостат на 2 сут., после чего их просматри-^ вают. Если на средах не появятся признаки роста, их считают стерильными и передают для химического контроля пс несколько образцов каждой серии; б)химический контроль: окончательно устанавливают рН, содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов (ил количество должно соответствовать указанному в рецепте).

Химический контроль сред производят в химической лаборатории; в) для биологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами микроорганизмов, и по их росту судят о питательных (ростовых) свойствах среды. К готовой среде прилагают этикетку и паспорт, в котором указывают название и состав среды, результаты контроля и др.

Хранят среды при комнатной температуре в шкафах, желательно специально для них предназначенных. Некоторые среды, например, среды с кровью и витаминами, хранят в холодильнике.

Рецепты приготовления простых (основных) сред и изотонического раствора натрия хлорида

Изотонический раствор натрия хлорида. К 1 л дистиллированной воды добавляют 9 г натрия хлорида. Раствор фильтруют, устанавливают заданный рН и, если нужно, стерилизуют при 120°С в течение 30 мин.

Мясопептонный бульон (МПБ). К мясной воде прибавляют 1% пептона и 0,5% х. ч. натрия хлорида, кипятят на слабом огне 10-15 мин для растворения веществ, устанавливают нужный рН и снова кипятят 30-40 мин до выпадения осадка. Фильтруют, доливают до первоначальною объема водой и стерилизуют 20 мин при 120°С.

Бульон Хоттингера. Перевар Хоттингера разводят водой 5-6 раз в зависимости от того, какое количество аминного азота он содержит и какое его количество должно быть в бульоне (указано в паспорте перевара и рецепте среды). Например, для приготовления среды с 1,2 гл аминного азота перевар, содержащий 9,0 гл, надо развести в 7,5 раз (9,0: 1,2). К разведенному перевару прибавляют 0,5% натрия хлорида и кипятят на слабом огне до растворения соли. В остывшей среде устанавливают рН, фильтруют, разливают и стерилизуют 20 мин при 120°С.

Мясопептонный агар (МПА). К готовому бульону (до стерилизации или после нее) добавляют 2-3% измельченного агар-агара и кипятят, помешивая, на слабом огне до; полного расплавления агара. МПА можно варить в автоклаве или аппарате Коха. Готовую среду, если нужно, осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 мин при 120°С. Полужидкий агар содержит 0,4-0,5% агар-агара.

Питательный желатин. К готовому бульону прибавляют 10-15% желатина, подогревают до его расплавления (не кипятят!), разливают в стерильную посуду и сте-i рилизуют текучим паром.

Рецепты приготовления сложных сред Среды с углеводами. К основному бульону или расплав-1 ленному агару прибавляют нужное количество (0,1-2%) определенного углевода (например, глюкозы). После его растворения разливают в стерильную посуду и стерилизуют] текучим паром. Поскольку углеводы частично разрушаются даже при таком режиме стерилизации, предпочтительнее 25- 30% раствор углеводов, простерилизованный через бактериальный фильтр, добавлять в нужном объеме с соблюдением | асептики к стерильным основным средам. После контроля] стерильности среда готова к употреблению.

Среды с кровью готовят из стерильных простых сред, добавляя в асептических условиях (лучше в боксе) от 3 дс 30% (обычно 5%) стерильной дефибринированной крови. Агаровые среды перед этим растапливают и остужают дс 45 °С. При нужной температуре должно быть терпимое ощущение горячего, но не ожога. После добавления крови, пока среда не застыла, содержимое сосуда тщательно перемеши* вают и разливают в чашки или пробирки.

Внимание! Среды с кровью растапливать нельзя - кровь изме-| нит свои свойства. Среды с сывороткой крови готовят так же, как среды кровью. К основным средам добавляют 10-20% сыворотки, не содержащей консерванта и предварительно инактиви-рованной при 56°С в течение 30 мин на водяной бане или: инактиваторе. При инактивации разрушается вещество (комплемент), губительно действующее на микробы.

Среды с желчью. К простым средам добавляют желчь в количестве 10-40% объема среды, устанавливают нужный рН и стерилизуют 20 мин при 120°С. Можно стерильную желчь добавить к стерильной среде в асептических условиях.

Разлив агаровых сред в чашки Петри. Среды перед разливом расплавляют на водяной бане и остужают до 45-50°С. Обычно для чашки диаметром 9 см достаточно 15-20 мл среды (высота слоя 0,25-0,3 см). Если слой выше, на нем менее контрастно выглядят колонии. При очень тонком слое резко ограничено количество питательных веществ и влаги (среда быстро высыхает) - ухудшаются условия культивирования.

Разливают среды в стерильные чашки в асептических условиях. Чашки ставят крышкой вверх. Сосуд со средой берут в правую руку, держа его у огня. Левой рукой вынимают пробку, зажав ее мизинцем и ладонью. Обжигают горлышко сосуда и двумя пальцами левой руки слегка приоткрывают крышку. Вводят под нее горлышко флакона, не прикасаясь им к краю чашки. Наливая среду, следят, чтобы она равномерно распределилась по дну чашки. Если при разливе на поверхности среды образуются пузырьки воздуха, к ним до того, как среда застынет, подносят пламя спички или горелки - пузырьки лопнут. Затем чашку закрывают и дают среде застыть. Если посев производят в день разлива, среду необходимо подсушить. Для этого чашки в термостате осторожно открывают и устанавливают крышки и чашки открытой стороной вниз на 20-30 мин. Если посев производят на следующий день после разлива, чашки, не подсушивая, завертывают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали, и помещают в холодильник.

Приготовление скошенного агара. Пробирки с 4-5 мл стерильной расплавленной агаровой среды укладывают в наклонном положении (примерно под углом 20°) с таким расчетом, чтобы среда не заходила за 23 пробирки, иначе она Может смочить пробку. После того как среда застынет, пробирки ставят вертикально - дают стечь конденсату. Лучше употреблять свежескошенный агар.

Внимание! Пользоваться средой, в которой нет конденсата, нельзя. Ее следует снова растопить на водяной бане и скосить.

Сухие среды

Отечественная промышленность выпускает сухие среды разного назначения: простые, элективные, дифференциально-диагностические, специальные. Это порошки во флаконах с завинчивающимися крышками. Хранят сухие среды в темном месте плотно закрытыми - они гигроскопичны. В лаборатории из порошков готовят среды по прописи на этикетке.

Преимущество сухих сред по сравнению со средами, изготовленными в лаборатории, - стандартность (их выпускают большими партиями), простота приготовления, делающая их доступными в любых (даже походных) условиях, стабильность, экономичность. Важно, что их можно готовить из заменителей мяса: гидролизата казеина, фибрина кильки и даже белковых фракций микробных клеток (са] цин).

Методы посевов

Важным этапом бактериологического исследования ляется посев. В зависимости от цели исследования, харак ра посевного материала и среды используют разные методь посева. Все они включают обязательную цель: оградить пс сев от посторонних микробов. Поэтому работать следует быстро, но без резких движений, усиливающих колебан* воздуха. Во время посевов нельзя разговаривать. ПосевМ лучше делать в боксе (при работе с заразным материалол необходимо выполнять правила личной безопасности).

Этапы выделения чистой культуры:

1-й день - получение изолированных колоний. Кашп исследуемого материала петлей, пипеткой или стеклянной палочкой наносят на поверхность агара в чашке Петри. Шпа-i телем втирают материал в поверхность среды; не прожиг и не перевертывая шпателя, производят посев на 2-й, а тем на 3-й чашке. При таком посеве на 1-ю чашку приходится много материала и соответственно много микробов, на 2-ю меньше и на 3-ю еще меньше.

Можно получить изолированные колонии при посеве петлей. Для этого исследуемый материал эмульгируют в бульоне или изотоническом растворе натрия хлорида.

2-й день - изучают рост микробов на чашках. В 1-й чашке обычно бывает сплошной рост - выделить изолированную колонию не удастся. На поверхности агара во 2-й и 3-й чашке вырастают изолированные колонии. Их изучают невооруженным глазом, с помощью лупы, при малом увеличении микроскопа и иногда в стереоскопическом микроскопе. Нужную колонию отмечают со стороны дна чашки и пересевают на скошенный агар. Посевы ставят в термостат. (Пересевать можно только изолированные колонии.)

3-й день - изучают характер роста на скошенном агаре. Делают мазок, окрашивают его и, убедившись в том, что культура чистая, приступают к ее изучению. На этом выделение чистой культуры заканчивается. Выделенная из определенного источника и изученная культура называется «штаммом».

При выделении чистой культуры из крови (гемокуль-туры) ее предварительно «подращивают» в жидкой среде: 10-15 мл стерильно взятой крови засевают в 100-150 мл жидкой среды. Так поступают потому, что в крови обычно мало микробов. Соотношение засеваемой крови и питательной среды 1: 10 не случайно - так достигается разведение крови (неразведенная кровь губительно действует на микроорганизмы). Колбы с посевом ставят в термостат. Через сутки (иногда через большее время, в зависимости от выделяемой культуры) из содержимого колб делают высевы на чашки для получения изолированных колоний. При необходимости повторяют высевы с интервалом в 2-3 дня.

При выделении чистой культуры из мочи, промывных вод желудка и других жидкостей их предварительно центрифугируют в асептических условиях и засевают осадок. Дальнейшее выделение чистой культуры производят обычным способом.

Для выделения чистой культуры широко применяют элективные среды. В ряде методов для получения чистых культур используют биологические особенности выделяемог микроба. Например, при выделении спорообразующих бак- терий посевы 10 мин прогревают при 80°С, убивая этим ве- гетативные формы. При выделении возбудителя туберкуле-j за, устойчивого к кислотам и щелочам, с помощью этих ве-1 ществ посевной материал освобождают от сопутствующей! флоры. Для выделения пневмококка и палочки чумы иссле-1 дуемый материал вводят белым мышам - в их организме высокочувствительном к данным возбудителям, эти микро-] бы размножаются быстрее других.

В научно-исследовательской работе, особенно при гене-; тических исследованиях, необходимо получать культуры за-1 ведомо из одной клетки. Такая культура называется «клон»] Для ее получения чаще всего пользуются микроманипуля-^ тором - прибором, снабженным инструментами (иглами] пипетками) микроскопических размеров. С помощью дер-j жателя под контролем микроскопа их вводят в препарат «B сячая капля», извлекают нужную клетку (одну) и переносят ее в питательную среду.

Изучение выделенных культур

Изучение морфологии, подвижности, тинкториальныл свойств, характера роста на средах (культуральные свойства);! ферментативной активности и ряда других особенностей вы! деленного микроба позволяет установить его таксономичес| кое положение, т. е. классифицировать микроорганизм: оп| ределить его род, вид, тип, подтип, разновидность. Это на зывается «идентификацией». Идентификация микроорганиз| мов очень важна при диагностике инфекций, установлена источников и путей ее передачи и в ряде других научно-л тических исследований.

Культуральные свойства

Различные виды микроорганизмов по-разному растут HJ| средах. Эти различия служат для их дифференциации. Оцщ хорошо растут на простых средах, другие - требовательнь и растут только на специальных. Микроорганизмы Moryi давать обильный (пышный) рост, умеренный или скудный Культуры могут быть бесцветными, сероватыми, серо-гсм лубыми. Культуры микроорганизмов, образующих пигмент, имеют разнообразную окраску: белую, желтую или золотистую у стафилококка, красную - у чудесной палочки, сине-зеленую - у сине-зеленой палочки, пигмент которой, растворимый в воде, окрашивает не только колонии, но и среду.

На плотных средах микроорганизмы в зависимости от количества посевного материала образуют или сплошной налет («газон»), или изолированные колонии. Культуры бывают грубые и нежные, прозрачные и непрозрачные, с поверхностью матовой, блестящей, гладкой, шероховатой, сухой, бугристой.

Колонии могут быть крупные (4-5 мм в диаметре и больше), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (меньше 1 мм). Они различаются по форме, расположению на поверхности среды (выпуклые, плоские, куполообразные, вдавленные, круглые, розеткообразные), форме краев (ровные, волнистые, изрезанные).

В жидких средах микроорганизмы могут образовывать равномерную муть, давать осадок (зернистый, пылевидный, хлопьевидный) или пленку (нежную, грубую, морщинистую).

На полужидких средах при посеве уколом подвижные микробы вызывают помутнение толщи среды, неподвижные - растут только по «уколу», оставляя остальную среду прозрачной.

Культуральные свойства определяют изучая характер роста культуры простым глазом, с помощью лупы, под малым увеличением микроскопа или пользуясь стереоскопическим микроскопом. Величину и форму колоний, форму краев и прозрачность изучают в проходящем свете, рассматривая чашки со стороны дна. В отраженном свете (со стороны крышки) определяют характер поверхности, окраску. Консистенцию определяют прикосновением петли.

Морфологические свойства

Изучение морфологии микробов тоже служит для их дифференциации. Морфологию изучают в окрашенных препаратах. Устанавливают форму и величину клеток, их расположение в препарате, наличие спор, капсул, жгутиков. В окрашенных препаратах определяют отношение микробов к краскам (тинкториальные свойства) - хорошо или плохо воспринимают краски, как относится к дифференциальным окраскам (в какой цвет окрашивается по Граму, Цилю-Нильсену и др.).

Данный учебник предназначен для студентов медицинских ВУЗов, учащихся медицинских колледжей, а также абитуриентов. В нем содержатся сведения об ультраструктуре и физиологии бактерий, рассматриваются вопросы иммунологии и вирусологии, подробно описаны строение и морфология возбудителей различных инфекций, уделено внимание основам медицинской биотехнологии и генной инженерии.

Тема 3. Физиология бактерий

1. Рост и размножение бактерий

Жизнедеятельность бактерий в основном характеризуется их ростом и размножением.

Рост бактерий – увеличение бактериальной клетки в размерах без увеличения числа особей в популяции. Рост всегда предшествует размножению.

Размножение бактерий – процесс, обеспечивающий увеличение числа особей в популяции. Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения, при этом она во многом зависит от видовой принадлежности бактерий и условий выращивания, которые включают в себя характер питательной среды, рН, температуру, аэрацию и др. Бактерии размножаются поперечным бинарным делением, при котором из одной материнской клетки образуются две одинаковые дочерние.

Процесс деления бактериальной клетки начинается с репликации хромосомной ДНК. В точке прикрепления хромосомы к цитоплазматической мембране (точке-репликаторе) действует белок-инициатор, который вызывает разрыв кольца хромосомы, и далее идет деспирализация ее нитей. Нити раскручиваются, и вторая нить прикрепляется к цитоплазматической мембране в точке-прорепликаторе, которая диаметрально противоположна точке-репликатору. За счет ДНК-полимераз по матрице каждой нити достраивается точная ее копия. Удвоение генетического материала – сигнал для удвоения числа органелл. В септальных мезосомах идет построение перегородки, делящей клетку пополам.

Двунитевая ДНК спирализуется, скручивается в кольцо в точке прикрепления к цитоплазматической мембране. Это является сигналом для расхождения клеток по септе. Образуются две дочерние особи.

На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток – колонии, видимые невооруженным глазом, различные по размерам, форме, поверхности, окраске, зависящей от пигмента бактерий, консистенции и т. д. Наиболее распространенными пигментами среди микроорганизмов являются меланины, каротины, ксантофиллы и другие, многие из которых обладают защитным, антимикробным, антибиотикоподобным эффектом. Вид, форма, цвет, консистенция и другие характерные особенности колоний учитываются при идентификации бактерий и отборе колоний для получения чистой культуры. При этом также следует учитывать, что внешний вид колоний характерен для определенных бактерий, но порой в большей степени зависит от условий культивирования.

На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения или осадка.

Размножение бактерий определяется временем генерации. Это период, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, состава питательной среды, температуры и др.

Фазы размножения бактериальной клетки на жидкой питательной среде:

1) начальная стационарная фаза; то количество бактерий, которое попало в питательную среду и в ней находится;

2) лаг-фаза (фаза покоя); продолжительность – 3–4 ч, происходит адаптация бактерий к питательной среде, начинается активный рост клеток, но активного размножения еще нет; в это время увеличивается количество белка, РНК;

3) фаза логарифмического размножения; активно идут процессы размножения клеток в популяции, размножение преобладает над гибелью;

4) максимальная стационарная фаза; бактерии достигают максимальной концентрации, т. е. максимального количества жизнеспособных особей в популяции; количество погибших бактерий равно количеству образующихся; дальнейшего увеличения числа особей не происходит;

5) фаза ускоренной гибели; процессы гибели преобладают над процессом размножения, так как истощаются питательные субстраты в среде. Накапливаются токсические продукты, продукты метаболизма. Этой фазы можно избежать, если использовать метод проточного культивирования: из питательной среды постоянно удаляются продукты метаболизма и восполняются питательные вещества.

Кроме размножения и роста, нормальная жизнедеятельность бактерий характеризуется и возрастной изменчивостью, т. е. способностью к изменению особей в разных стадиях роста, созревания и старения.

2. Питание бактерий

Под питанием понимают процессы поступления и выведения питательных веществ в клетку и из клетки. Питание в первую очередь обеспечивает размножение и метаболизм клетки. Стоит отметить, что бактериальные клетки не имеют специальных органов питания, поэтому являются голофитными.

Среди необходимых питательных веществ выделяют органогены – это девять химических элементов, концентрация которых в бактериальной клетке превосходит 10–4 моль. К ним относят углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, магний, кальций, сера.

Кроме органогенов, необходимы микроэлементы. Они обеспечивают активность ферментов. Это цинк, марганец, молибден, кобальт, медь, никель, вольфрам, натрий, хлор.

Для бактерий характерно многообразие источников получения питательных веществ.

В зависимости от источника получения углерода бактерии делят на:

1) аутотрофы (используют неорганические вещества – СО 2 и не нуждаются в сложных органических соединениях);

2) гетеротрофы (используют в качестве источника углерода разнообразные органические углеродосодержащие соединения, которыми являются углеводы, углеводороды, аминокислоты и органические кислоты);

3) метатрофы (используют органические вещества неживой природы);

4) паратрофы (используют органические вещества живой природы).

Процессы питания должны обеспечивать энергетические потребности бактериальной клетки.

По источникам энергии микроорганизмы делят на:

1) фототрофы (способны использовать солнечную энергию);

2) хемотрофы (получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций);

3) хемолитотрофы (используют неорганические соединения);

4) хемоорганотрофы (используют органические вещества). Факторами роста бактерий являются витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, присутствие которых ускоряет рост.

Среди бактерий выделяют:

1) прототрофы (способны сами синтезировать необходимые вещества из низкоорганизованных);

2) ауксотрофы (являются мутантами прототрофов, потерявшими гены; ответственны за синтез некоторых веществ – витаминов, аминокислот, поэтому нуждаются в этих веществах в готовом виде).

Микроорганизмы ассимилируют питательные вещества в виде небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры могут служить источниками питания только после расщепления их экзоферментами до более простых соединений.

Метаболиты и ионы поступают в микробную клетку различными путями.

Пути поступления метаболитов и ионов в микробную клетку:

1) пассивный транспорт (без энергетических затрат):

а) простая диффузия;

б) облегченная диффузия (по градиенту концентрации, с помощью белков-переносчиков);

2) активный транспорт (с затратой энергии, против градиента концентрации; при этом происходит взаимодействие субстрата с белком-переносчиком на поверхности цитоплазматической мембраны).

Встречаются модифицированные варианты активного транспорта – перенос химических групп. В роли белков-переносчиков выступают фосфорилированные ферменты, поэтому субстрат переносится в фосфорилированной форме. Такой перенос химической группы называется транслокацией.

3. Метаболизм бактериальной клетки

Обмен веществ (метаболизм) по сути является совокупностью двух взаимосвязанных противоположных процессов – катаболизма (диссимиляции), который представляет собой распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопления выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ, и анаболизма (ассимиляции), представляющего собой синтез веществ с затратой энергии.

Изучение обмена веществ у бактерий возможно с помощью применения физико-химических и биохимических методов исследования, которые проводятся в ходе культивирования бактерий в определенных условиях на специальных питательных средах, содержащих определенное соединение в качестве субстрата для трансформации.

Особенности метаболизма у бактерий:

1) многообразие используемых субстратов;

2) интенсивность процессов метаболизма;

4) преобладание процессов распада над процессами синтеза;

5) наличие экзо– и эндоферментов метаболизма.

В процессе метаболизма выделяют два вида обмена:

1) пластический (конструктивный):

а) анаболизм (с затратами энергии);

б) катаболизм (с выделением энергии);

2) энергетический обмен (протекает в дыхательных мезосомах):

а) дыхание;

б) брожение.

В зависимости от акцептора протонов и электронов среди бактерий различают аэробы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Аэробы способны получать энергию только путем дыхания и постоянно нуждаются в молекулярном кислороде как конечном акцепторе электронов. Для них характерно окисление, при котором конечным акцептором электронов является кислород.

Облигатные анаэробы растут только в бескислородной среде или в среде с низким значением редокс-потенциала (Eh). Как тип окислительно-восстановительных процессов для них характерна ферментация с переносом электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору. Из этого можно сделать вывод, что для облигатных анаэробов характерно только брожение, в кислородных условиях наступает гибель микроорганизма из-за образования перекисей, идет отравление клетки.

Факультативные анаэробы способны расти как в присутствии кислорода, так и в его отсутствие, используя при этом в качестве терминальных акцепторов электронов молекулярный кислород или органические соединения. Кроме того, среди факультативных анаэробов встречаются бактерии, способные переключаться с окисления на ферментацию, а также такие бактерии, которые способны расти в присутствии атмосферного кислорода, при этом не используя его, а энергию получают исключительно с помощью брожения.

В микробной клетке ферменты являются биологическими катализаторами, отличающимися от других катализаторов исключительной эффективностью и высокой специфичностью как в отношении природы катализируемой реакции, так и в отношении структуры субстрата. Ферменты обеспечивают протекание реакций в физиологических условиях. Скорость этих реакций зависит от условий, в которых находится данный микроорганизм, в частности от температуры среды, ее рН и других факторов.

По строению среди ферментов выделяют:

1) простые ферменты (белки);

2) сложные; состоят из белковой (активного центра) и небелковой частей; необходимы для активизации ферментов.

Различают также:

1) конституитивные ферменты (синтезируются постоянно независимо от наличия субстрата);

2) индуцибельные ферменты (синтезируются только в присутствии субстрата).

Набор ферментов в клетке строго индивидуален для вида. Способность микроорганизма утилизировать субстраты за счет своего набора ферментов определяет его биохимические свойства.

Ферменты, образуемые микроорганизмами, могут локализоваться в различных частях клетки или быть связанными с ее иными структурами, также могут выделяться в окружающую среду. Поэтому по месту действия ферментов среди них выделяют:

1) экзоферменты – действуют вне клетки; принимают участие в процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной клетки; характерны для грамположительных бактерий;

2) эндоферменты – действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ.

В зависимости от катализируемых химических реакций все ферменты делят на шесть классов:

1) оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции между двумя субстратами);

2) трансферазы (осуществляют межмолекулярный перенос химических групп);

3) гидролазы (осуществляют гидролитическое расщепление внутримолекулярных связей);

4) лиазы (присоединяют химические группы по двум связям, а также осуществляют обратные реакции);

5) изомеразы (осуществляют процессы изомеризации, обеспечивают внутреннюю конверсию с образованием различных изомеров);

6) лигазы, или синтетазы (соединяют две молекулы, вследствие чего происходит расщепление пирофосфатных связей в молекуле АТФ).

Любой микроорганизм имеет свой ферментный состав, который определяется его геномом и является достаточно постоянным признаком. Поэтому определение ферментов имеет большое значение при дифференцировке и идентификации бактерий. При этом некоторые ферменты могут способствовать проявлению патогенных свойств различными возбудителями инфекционных болезней человека.

4. Виды пластического обмена

Основными видами пластического обмена являются:

1) белковый;

2) углеводный;

3) липидный;

4) нуклеиновый;

5) минеральный.

Белковый обмен характеризуется катаболизмом и анаболизмом. В процессе катаболизма бактерии разлагают белки под действием протеаз с образованием пептидов. Под действием пептидаз из пептидов образуются аминокислоты.

Распад белков в аэробных условиях называется тлением, в анаэробных – гниением.

В результате распада аминокислот клетка получает ионы аммония, необходимые для формирования собственных аминокислот. Бактериальные клетки способны синтезировать все 20 аминокислот. Ведущими из них являются аланин, глютамин, аспарагин. Они включаются в процессы переаминирования и трансаминирования. В белковом обмене процессы синтеза преобладают над распадом, при этом происходит потребление энергии.

В углеводном обмене у бактерий катаболизм преобладает над анаболизмом. Сложные углеводы внешней среды могут расщеплять только те бактерии, которые выделяют ферменты – полисахаридазы. Полисахариды расщепляются до дисахаров, которые под действием олигосахаридаз распадаются до моносахаров, причем внутрь клетки может поступать только глюкоза. Часть ее идет на синтез собственных полисахаридов в клетке, другая часть подвергается дальнейшему расщеплению, которое может идти по двум путям: по пути анаэробного распада углеводов – брожению (гликолизу) и в аэробных условиях – по пути горения.

В зависимости от конечных продуктов выделяют следующие виды брожения:

1) спиртовое (характерно для грибов);

2) пропионионово-кислое (характерно для клостридий, пропиони-бактерий);

3) молочно-кислое (характерно для стрептококков);

4) масляно-кислое (характерно для сарцин);

5) бутилденгликолевое (характерно для бацилл).

Наряду с основным анаэробным распадом (гликолизом) могут быть вспомогательные пути расщепления углеводов (пентозофосфатный, кетодезоксифосфоглюконатный и др.) Они отличаются ключевыми продуктами и реакциями.

Липидный обмен осуществляется с помощью ферментов – липопротеиназ, летициназ, липаз, фосфолипаз.

Липазы катализируют распад нейтральных жирных кислот, т. е. ответственны за отщепление этих кислот от глицерина. При распаде жирных кислот клетка запасает энергию. Конечным продуктом распада является ацетил-КоА.

Биосинтез липидов осуществляется за счет ацетилпереносящих белков. При этом ацетильный остаток переходит на глицерофосфат с образованием фосфатидных кислот, а они уже вступают в химические реакции с образованием сложных эфиров со спиртами. Эти превращения лежат в основе синтеза фосфолипидов.

Бактерии способны синтезировать как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты, но синтез последних более характерен для аэробов, так как требует кислорода.

Нуклеиновый обмен бактерий связан с генетическим обменом. Синтез нуклеиновых кислот имеет значение для процесса деления клетки. Синтез осуществляется с помощью ферментов: рестриктазы, ДНК-полимеразы, лигазы, ДНК-зависимые-РНК-полимеразы.

Рестриктазы вырезают участки ДНК, убирая нежелательные вставки, а лигазы обеспечивают сшивку фрагментов нуклеиновой кислоты. ДНК-полимеразы ответственны за репликацию дочерней ДНК по материнской. ДНК-зависимые-РНК-полимеразы отвечают за транскрипцию, осуществляют построение РНК на матрице ДНК.

Минеральный обмен важен для синтеза тела бактерий. Для него необходимы не только азот и углерод, но и зольные элементы – сера, фосфор, калий и кальций, а также микроэлементы – бор, молибден, цинк, марганец, кобальт, никель, йод, бром, медь и др. В состав цитоплазмы бактерий входит сера, которая участвует в синтетических реакциях в виде R-SH. Данная сера восстановленной формы обладает высокой реактивностью и легко поддается дегидрированию с последующим превращением в сложные соединения, которые при гидрировании восстанавливаются, благодаря чему регулируется окислительно-восстановительный потенциал в цитоплазме бактерии.

В нуклеиновых кислотах, многих ферментах, различных фосфолипидах и других органических соединениях содержится фосфор, который не вступает в непосредственное соединение с углеродом, но образует связи через атомы кислорода. В процессе окислительных реакций высвобождается энергия, аккумулированная в цитоплазме клеток. При этом большую роль в энергетическом обмене в клетке играют АТФ– и АДФ-кислоты. Кроме того, фосфор входит в состав нуклеопротеидов, фосфолипидов, простетических групп большинства двухкомпонентных ферментов, являющихся важнейшими соединениями цитоплазмы.

Для нормального развития микроорганизмов необходимы катионы и анионы многих металлов, в том числе магния, кальция, железа. Микроэлементы участвуют в синтезе ферментов и активизируют их.

Физиология бактерий

Физиология бактерий изучает жизнеде­ятельность, метаболизм бактерий, вопросы питания, получения энергии роста и размно­жения бактерий, а также их взаимодействие с окружающей средой. Метаболизм бактерий лежит в основе изучения и разработки мето­дов их культивирования, получения чистых культур и их идентификации. Выяснение фи­зиологии патогенных и условно-патогенных бактерий важно для изучения патогенеза вы­зываемых ими инфекционных болезней, для постановки микробиологической диагности­ки, проведения лечения и профилактики ин­фекционных заболеваний, регуляции взаимо­отношения человека с окружающей средой, а также для использования бактерий в биотех­нологических процессах с целью получения биологически активных веществ.

Химический состав бактериальной клетки.

Бактериальная клетка на 80-90 % состоит из воды , и только 10% приходится на долю сухого вещества. Вода в клетке находится в свободном или связанном состоянии. Она выполняет механическую роль в обеспечении тургора, участвует в гидролитических реакци­ях. Удаление воды из клетки путем высуши­вания приводит к приостановке процессов метаболизма, прекращению размножения. Высушивание микроорганизмов в вакууме из замороженного состояния (лиофилизация) прекращает размножение микробов и спо­собствует длительному их сохранению.

Состав сухого вещества распределен следу­ющим образом:

52 % составляют белки, 17 % - углеводы, 9 % - липиды, 16 % - РНК, 3 % - ДНК и 3 % - минеральные вещества.

Белки являются ферментами, а также со­ставной частью клетки, входят в состав цитоплазматической мембраны (ЦПМ) и ее производных, клеточной стенки, жгутиков, спор и некоторых капсул. Некоторые бактериальные белки являются антигенами и токсинами бак­терий. В состав белков бактерий входят от­сутствующие у человека Д-аминокислоты, а также диаминопимелиновая кислота.

Углеводы представлены в бактериальной клетке в виде моно-, ди-, олигосахаров и полисахаридов, а также входят в состав ком­плексных соединений с белками, липидами и другими соединениями. Полисахариды нахо­дятся в составе некоторых капсул, клеточной стенки; крахмал и гликоген являются запас­ными питательными веществами. Некоторые полисахариды принимают участие в форми­ровании антигенов.

Липиды или жиры входят в состав ЦПМ и ее производных, клеточной стенки гра мотрицательных бактерий, а также служат запасными веществами, входят в состав эн­дотоксина грамотрицательных бактерий, в составе ЛПС формируют антигены . В бак­териальных жирах преобладают длинноцепочечные (С 14-С18) насыщенные жирные кислоты и ненасыщенные жирные кислоты, содержащие одну двойную связь. Сложные липиды представлены фосфатидилинозитом. фосфатидилглицерином и фосфатидилэтаноламином. У некоторых бактерий в клетке находятся воски, эфиры миколовой кислоты . Микоплазмы - единственные представители царства Procaryotae , имеющие в составе ЦПМ стеролы. Остальные бактерии в составе ЦПМ и ее производных не имеют стеролов.

Нуклеиновые кислоты . В бактериальной клетке присутствуют все типы РНК: иРНК, тРНК, рРНК. Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды - это те строительные блоки, из которых синтезируются нуклеиновые кисло­ты. Кроме того, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды входят в состав многих кофермен-тов и служат для активации и переноса амино­кислот, моносахаров, органических кислот.

ДНК выполняет в бактериальной клетке на­следственную функцию. Молекула ДНК постро­ена из двух полинуклеотидных цепочек. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара дезоксирибозы и фосфатной группы (рис. 3.1, а). Азотистые основания представле­ны пуринами(аденин, гуанин) и пиримидинами (тимин, цитозин). Каждый нуклеотид обладает полярностью. У него имеется дезоксирибозный З"-конец и фосфатный 5"-конец. Нуклеотиды со­единяются в полинуклеотидную цепочку пос­редством фосфодиэфирных связей между 5"-кон-цом одного нуклеотида и З"-концом другого. Сцепление между двумя цепями обеспе­чивается водородными связями между компле­ментарными азотистыми основаниями: аденина с тимином, гуанина с цитозином. Нуклеотидные цепи антипараллельны: на каждом из концов линейной молекулы ДНК расположен 5"-конец одной цепи и З"-конец другой цепи. Процентное содержание количества гуанинцитозин(ГЦ)-пар в ДНК определяет степень родства между бактери­ями и используется при определении таксономи­ческого положения бактерий.

Минеральные вещества обнаруживаются в золе, полученной после сжигания клеток. В большом количестве представлены мине­ральные вещества: N, S, Р, Са, К, Mg, Fe, Mn, а также микроэлементы: Zn, Си, Со, Ва.

Азот входит в состав белков, нуклеотидов, коферментов. Сера входит в виде сульфгид-рильных групп в структуру белков. Фосфор в виде фосфатов представлен в нуклеиновых кислотах, АТФ, коферментах. В качестве ак­тиваторов ферментов используются ионы Mg, Fe, Mn. Ионы К и Mg необходимы для акти­вации рибосом. Са является составной частью клеточной стенки грамположительных бакте­рий. У многих бактерий имеются сидерохро- мы, которые обеспечивают транспортировку ионов Fe внутрь клетки в виде растворимых комплексных соединений.

"Классификация бактерий по типам питания и способам получения энергии.

Основной целью метаболизма бактерий является рост, т. е. коор­динированное увеличение всех компонентов клетки. Поскольку основными компонентами бактериальной клетки являются органические соединения, белки, углеводы, нуклеиновые кислоты и липиды, остов которых построен из атомов углерода, то для роста требуется посто­янный приток атомов углерода. В зависимости от источника усвояемого углерода бактерии подразделяют по типам на:

ауготрофы, которые используют для построения своих клеток неорганический углерод, в виде СО,; гетеротрофы (от феч. heteros - другой), которые используют органический углерод. Легко усвояемыми источниками органи­ческого углерода являются гексозы, многоатомные спирты, аминокислоты.

Белки, жиры, углеводы и нуклеиновые кислоты являются крупными полимерными молекулами, которые синтезируются из мо­номеров в реакциях поликонденсации, про­текающих с поглощением энергии. Поэтому для восполнения своей биомассы бактериям помимо источника углерода требуется источ­ник энергии. Энергия запасается бактериаль­ ной клеткой в форме молекул АТФ.

Организмы, для которых источником энергии является слет, называются фототрофами. Те организмы, которые получают энергию за счет окислительно-восстановительных реак ций , называются хемотрофами.

Среди хемотрофов выделяют литотрофы (от греч. lithos - камень), способные использо­вать неорганические доноры электронов (Н 2 , NH 3 , H 2 S, Fe 2+ и др.) и органотрофы, которые используют в качестве доноров электронов органические соединения.

Бактерии, изучаемые медицинской мик­робиологией, являются гетерохемоорганот рофами . Отличительной особенностью этой группы является то, что источник углерода у них является источником энергии. Учитывая разнообразие микромира и типов метаболиз­ма, далее изложение материала ограничено рассмотрением метаболизма у гетерохемоорганотрофов.

Транспорт веществ в бактериальную клетку

Для того, чтобы питательные вещества мог­ли подвергнуться превращениям в цитоплаз­ме клетки, они должны проникнуть в клетку через пограничные слои. Ответственность за поступление в клетку питательных веществ лежит на ЦПМ.

Существует два типа переноса веществ в бак­териальную клетку:

пассивный

активный.

При пассивном переносе вещество прони­кает в клетку только по градиенту концентра­ции. Затрат энергии при этом не происходит. Различают две разновидности пассивного пе­ реноса :

простую диффузию

облегченную диффузию.

Простая диффузия - неспецифи­ческое проникновение веществ в клетку, при этом решающее значение имеет величина мо­лекул и липофильность. Скорость переноса незначительна.

Облегченная диффузия проте­кает с участием белка-переносчика. Скорость этого способа переноса зависит от концентра­ции вещества в наружном слое.

При активном переносе вещество про­никает в клетку против градиента концен­трации при помощи белка-переносчика - пермеазы. При этом происходит затрата энергии . Имеется два типа активного транс­ порта. При одном типе активного транс порта небольшие молекулы (аминокислоты, некоторые сахара) «накачиваются» в клетку и создают концентрацию, которая может в 100-1000 раз превышать концентрацию этого вещества снаружи клетки. Второй ме­ханизм, получивший название транслока­ ция радикалов, обеспечивает включение в клетку некоторых сахаров (например, глю­козы, фруктозы), которые в процессе пе­реноса фосфорилируются, т. е. химически модифицируются. Для осуществления этих процессов в бактериальной клетке лока­лизуется специальная фосфотрансферная система, составной частью которой является белок-переносчик, находящий­ся в активной фосфорилированной фор­ме. Фосфорилированный белок связывает свободный сахар на наружной поверхности мембраны и транспортирует его в цитоплаз­му, где сахар освобождается в виде фосфата. Поступив в клетку, органический источник углерода и энергии вступает в цепь биохимичес­ких реакций, в результате которых образуются АТФ и ингредиенты для биосинтетических про­цессов. Биосинтетические (конструктивные) и энергетические процессы протекают в клетке одновременно. Они тесно связаны между собой через общие промежуточные продукты, кото­рые называются амфиболитами.

Культивирование бактерий в системах in vi ­ tro осуществляется на питательных средах. Искусственные питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

Каждая питательная среда должна со­ держать воду , так как все процессы жизнеде­ятельности бактерий протекают в воде.

Для культивирования гетероорганотрофных бактерий в среде должен содержаться органический источник углерода и энергии. Эту функцию выполняют различные органи­ческие соединения: углеводы, аминокислоты, органические кислоты, липиды. Наибольшим энергетическим потенциалом обладает глюко­за, так как она непосредственно подвергается расщеплению с образованием АТФ и ингре­диентов для биосинтетических путей. Часто используется в этих целях пептон - продукт неполного гидролиза белков, состоящий из поли-,олиго- и дипептидов. Пептон также поставляет аминокислоты для построения бактериальных белков.

Для синтеза белков, нуклеотидов, АТФ, коферментов бактериям требуются источни­ки азота, серы, фосфаты и другие минераль­ные вещества, в том числе микроэлементы.

Источником азота может служить пептон; кроме того, большинство бактерий способны использовать соли аммония в качестве источ­ника азота.

Серу и фосфор бактерии способны утили­зировать в виде неорганических солей: суль­фатов и фосфатов.

Для нормального функционирования фер­ментов бактериям требуются ионы Са 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ , которые добавляют в питательную среду в виде солей, чаще всего фосфатов.

4. Решающее значение для роста мно­гих микроорганизмов имеет рН среды. Поддерживание определенного рН имеет значение для предотвращения гибели мик­роорганизмов от ими же образованных про­дуктов обмена. С этой целью питательную среду забуферивают, чаще всего используя фосфатный буфер. При сильном выделении бактериями кислот, как продуктов обмена, добавляют к питательной среде карбонат кальция СаС1 2 .

5. Среда должна обладать определенным ос­ мотическим давлением. Большинство бакте­рий способны расти на изотоничных средах, изотоничность которых достигается добавле­нием NaCl в концентрации 0,87 %. Некоторые бактерии не способны расти на средах при концентрации соли в них ниже 1 %. Такие бактерии называются галофильными.

Так как устойчивость к осмотическому дав­лению определяется наличием у бактерий клеточной стенки, бактерии, лишенные кле­точной стенки, микоплазмы L-формы могут расти на питательных средах, содержащих гипертонический раствор, обычно сахарозы.

При необходимости к питательной среде добавляют факторы роста, ингибиторы роста определенных бактерий, субстраты для дейс­твия ферментов, индикаторы.

6 . Питательные среды должны быть сте­ рильными.

В зависимости от консистенции питатель­ ные среды могут быть:

1. полужидки­ми

   плотными.

Плотность среды достигается добавлением агара.

Агар - полисахарид, получаемый из водо­рослей. Он плавится при температуре 100 °С, но при охлаждении остывает при температу­ре 45-50 °С. Агар добавляют в концентрации 0,5 % - для полужидких сред и 1,5-2 % - для создания плотных сред.

В зависимости от со­става и цели применения различают:

2. элективные,

   минимальные,

   диффе­ренциально-диагностические

   комбинирован­ные среды.

По составу питательные среды могут быть простыми и сложными.

К простым средам от­носятся пептонная вода, питательный бульон, мясопептонный агар.

На основе этих простых сред готовят сложные, например сахарный и сывороточный бульоны, кровяной агар.

В зависимости от назначения среды под­разделяются на элективные, обогащенные, дифференциально-диагностические.

Под элективными понимают среды, на ко­торых лучше растет какой-то определенный микроорганизм. Например, щелочной агар, имеющий рН 9, служит для выделения холер­ного вибриона. Другие бактерии, в частности кишечная палочка, из-за высокого рН на этой среде не растут.

Среды обогащения - это такие среды, кото­рые стимулируют рост какого-то определен­ного микроорганизма, ингибируя рост других. Например, среда, содержащая селенит натрия, стимулирует рост бактерий рода Salmonella , ингибируя рост кишечной палочки.

среды служат для изучения ферментативной активности бактерий. Они состоят из простой пи­тательной среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цвет в результа­те ферментативного превращения субстрата. Примером таких сред являются среды Гисса, используемые для изучения способности бак­терий ферментировать сахара.

Комбинированные питательные среды со­четают в себе элективную среду, подавля­ющую рост сопутствующей флоры, и диф­ференциальную среду, диагностирующую ферментативную активность выделяемого микроба. Примером таких сред служат среда Плоскирева и висмут-сульфитный агар, ис­пользуемые при выделении патогенных ки­шечных бактерий. Обе эти среды ингибируют рост кишечной палочки.

Питательные среды . Применяют для выращивания (культи­вирования) микроорганизмов в лабораторных или промышлен­ных условиях. Любая питательная среда должна отвечать сле­дующим требованиям:

иметь оптимальные для бактерий физико-химические свойства: рН, влажность, осмолярность и др.

Для жизнедеятельности микробной клетки, безусловно, не­обходима вода как основной растворитель и среда для проте­кания всех биохимических реакций.

В бактериологической практике используют среды, различ­ные по происхождению.

Синтетическими питательными сре­дами называют такие, которые состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. Пре­имуществом синтетических сред являются их строго постоян­ный состав и воспроизводимость.

Полусинтетические среды включают наряду с химически чистыми соединениями переработанные нативные компоненты неопределенного состава - гидролизаты мяса, дрожжевой экстракт и т.д.

Натуральные питательные среды представляют собой неизмененные натив­ные (природные) компоненты (сыворотка крови, яичный белок и др.).

Различные потребности микробов отдельных видов обуслов­ливают большое разнообразие питательных сред.

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Для придания плотной консистен­ции к жидкой среде добавляют агар-агар, представляющий собой продукт переработки особого вида морских водорослей. Агар-агар плавится при 80-86 °С, затвердевает при темпера­туре около 40 "Сив застывшем состоянии придает среде плот­ность. В плотные среды добавляют 1,5-2 %, в полужидкие - 0,3-0,7 % агар-агара. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют нативные компоненты (свернувшаяся сыворотка крови, свернувшийся яичный белок), которые сами по себе являются плотными.

Преимуществом плотных питательных сред является воз­можность получения чистых культур микроорганизмов, а также сообществ микроорганизмов (колоний, бактериальных газо­нов), имеющих макроскопические размеры.

По целевому назначению питательные среды делят на основ­ные, элективные и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращива­ния многих бактерий. Это пептические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду - питательный бульон и плотную - пи­тательный агар. Такие среды также служат основой для приго­товления сложных питательных сред - сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бак­терий.

Элективные питательные среды предназначены для избира­тельного выделения и накопления микроорганизмов опреде­ленного вида (или определенной группы) из материалов, со­держащих разнообразную постороннюю микрофлору. При со­здании элективных питательных сред исходят из биологичес­ких особенностей, которые отличают данные микробы от боль­шинства других. Например, избирательный рост стафилокок­ков наблюдается при повышенной концентрации хлорида на­трия, холерного вибриона - в щелочной среде и т.д.

Дифференциально-диагностические питательные среды при­меняют для различения (дифференциации) отдельных видов (или групп) микробов. Принцип составления этих сред осно­ван на различиях в биохимической активности бактерий раз­ных видов вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав дифференциально-диагностической среды входят следующие компоненты: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, б) определенный углевод (например, лактоза), способность использовать который явля­ется диагностическим признаком для данного вида, в) цвет­ной индикатор (например, индикатор Андреде), изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге рН среды в кислую сторону вследствие ферментации соответствующего углевода. Дифференциально-диагностические среды широко использу­ют в лабораторных микробиологических диагностических исследованиях для дифференциации и идентификации бак­терий.

Культивирование бактерий применяют, в частности, для выделения и идентификации чистых культур

а Выделение чистой культуры бактерий

Выделение отдельных видов бактерий из исследуемого ма­териала, содержащего, как правило, смесь различных микро­организмов, является одним из этапов любого бактериологи­ческого исследования, проводимого с различными целями: диагностики заболеваний, определения микробной обсемененности окружающей среды и т.д.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному при­знаку на биологические варианты - биовары. Биовары, разли­чающиеся по биохимическим свойствам, называют хемовара ми, по антигенным свойствам - сероварами, по чувствитель­ности к фагу - фаговарами и т.д. Культуры микроорганизмов одного и того же вида или биовара, выделенные из различных источников либо в разное время из одного и того же источни­ка, называют штаммами , которые обычно обозначают номера­ми, какими-либо символами.

Колония представляет собой видимое изолированное сооб­щество микроорганизмов одного вида, образующееся в резуль­тате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее).

Методы выделения чистой культуры

Для выделения чистой культуры применяют методы, ос­нованные на:

механическом разобщении бактериальных клеток;

предварительной обработке исследуемого материала физическими или химическими факторами, оказыва­ющими избирательное антибактериальное действие;

избирательном подавлении размножения сопутствую­щей микрофлоры физическими или химическими факторами во время инкубации посевов;

способности некоторых бактерий быстро размножать­ся в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопробы).

Основные среды .

Пептонный бульон . Выпускается в сухом виде; состав (г/л): триптический гидролизат кильки; натрия хлорид - 4,95.

Питательный агар. Состав (г/л): ферментативный гидролизат кормовых дрожжей - 12,0; агар - 12,5; натрия хлорид 5,5; рН 7,3+0,1.

основные сложные среды -кровяные, сывороточные . Их готовят путем добавления к питательному ашру 5-10 % дефибринированной крови или сыворотки крови либо 25 % асцитической жидкости. Для приготовления ЖИДКОЙ среды такие же количества сыворотки или асцитической жидкости добавляют к питательному бульону. «Агар Мюллера-Хинтон (основная плотная питательная среда для определения чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков): на 1 л дистиллированной воды мясного настоя (из говядины), 17,5 г гидролизата казеина, Уф г крахмала, 17 г агар-агара.

Элективные питательные среды. Пептонная вода 1 %, рй 8,0. Избирательная для холерного вибриона, который размножается быстро, опережая рост других микроорганизмов. Щелочная реакция среды не препятствует росту возбудителя холеры Vibrio cholerae , но тормозит рост других микроорганиз­мов.

Щелочной агар (плотная среда): питательный агар, рН 7,8, аналогично предыдущей среде элективен для V . cholerae . - Среда Леффлера. Смесь 1 части лошадиной сыворотки и 3 частей сахарного бульона, скошенная в пробирках при нагревании в аппарате Коха, элективна для возбудителя диф­терии Corynebacterium diphtheriae .

■УЖелточно-солевой агар (ЖСА). Содержит повышенные концентрации хлорида натрия (8-10 %), которые не препятствуют размножению стафилококков, что обеспечивает селективность среды для данных микроорганизмов. Среда позволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие лецитиназу, от стафилококков, не выделяющих этот фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком вокруг колоний лецитиназоположительных видов (фермент расщепляет лецитин куриного желтка, который вносится в рас­плавленный и остуженный до 45 "С питательный солевой агар).

Дифференциально-диагностические среды .

Среды Гисса . К 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит и др.) и индика­тор Андреде (кислый фуксин в 1 н. растворе NaOH), разливают по пробиркам. В пробирки помещают поплавок (трубка длиной около 3 см, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении угле­водов. Среда при рН 7,2-7,4 бесцветна. При разложении уг­леводов она приобретает красный цвет.

Среда Ресселя. Применяется при изучении биохими­ческих свойств энтеробактерий (шигелл, сальмонелл). Содер­жит питательный агар, лактозу, глюкозу и индикатор бромти-моловый синий. Приготавливают в пробирках по 6-8 мл в виде столбика со скошенной поверхностью. Цвет незасеянной среды травянисто-зеленый. Посев делают штрихом по скошен­ной поверхности и уколом в глубину столбика. Микроорганиз­мы, ферментирующие глюкозу до кислоты, вызывают измене­ние окраски столбика среды из первоначальной травянисто-зе­леной в желтую; скошенная поверхность при этом приобретает синий цвет. Лактозоположительные микроорганизмы (£. со/0 изменяют цвет столбика и скошенной части среды в желтый. Микроорганизмы, образующие щелочь, изменяют цвет среды в синий. Газообразование отмечается в толще столбика среды.

Среда Эндо. Выпускается в виде порошка, который со­стоит из высушенного питательного агара с 1 % лактозы и индикатора - основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Свежеприготовленная среда бесцветна или бледно-ро­зовая. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блес­ком; лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные ко­лонии.

Среда Плоскирева (бактоагар Ж). Выпускается в сухом виде и содержит питательный агар с лактозой, брилли­антовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными со­лями и индикатором (нейтральный красный). Эта среда является не только дифференциально-диагностической, но и селек­тивной, так как подавляет рост многих микроорганизмов (ки­шечная палочка и др.) и способствует лучшему росту некото­рых патогенных бактерий (возбудители брюшного тифа, пара-тифов, дизентерии). Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные - красные.

Висмут-сульфит агар . Выпускается в сухом виде; со­держит триптический гидролизат кильки, глюкозу, неоргани­ческие соли, бриллиантовый зеленый, агар. Среда предназна­чена для выделения сальмонелл. Дифференцирующие свойства среды основаны на-способности микроорганизмов продуциро­вать H2S, который вступает в реакцию с цитратом висмута и образует соединение черного цвета - сульфит висмута. Среда резко угнетает рост сопутствующей микрофлоры за счет инги-бирующего действия бриллиантового зеленого и сульфита на­трия.

Физиология микроорганизмов — раздел микробиологии, изучающий химический состав, процессы питания, дыхания и размножения микроорганизмов.

Химический состав бактерий

Вода. Основная составная часть бактериальной клетки — 75—85 %. Соответственно сухое вещество составляет 15—25 %. Часть воды находится в свободном состоянии, а часть — в связанном. Связанная вода является структурным растворителем. Свободная вода служит дисперсионной средой для коллоидов и растворителем для кристаллических веществ, источником водородных и гидроксильных ионов. Например, гидролитические процессы расщепления белков, углеводов и липидов происходят в результате присоединения к ним воды, а путем отщепления элементов воды могут синтезироваться новые сложные молекулы.

Какие же химические элементы содержатся в микробной клетке? Ведущая роль принадлежит четырем органогенам — кислороду, водороду, углероду и азоту. В процентном отношении к сухому веществу бактерии содержат: углерода — 45—55, азота — 8—15, кислорода — 30, водорода — 6—8. Соответственно дрожжи содержат (%): углерода — 49, азота — 12, кислорода — 31, водорода — 6. В микроскопических грибах (%): углерода — 47, азота — 5, кислорода — 40, водорода — 6.

Минеральные вещества. Кроме органогенов в микробных клетках находятся так называемые зольные элементы— минеральные вещества, составляющие от 3 до 10 % сухого вещества микроорганизмов. Среди них преимущественное значение имеет фосфор, который входит в состав нуклеиновых кислот, липидов, фосфолипидов. Сера содержится в аминокислотах, например в цистине и цистеине. Магний обеспечивает активность ряда ферментов, например протеазы. Микробы без магния не способны проявлять протеолитические свойства. Железо является необходимым элементом для осуществления процессов дыхания и энергетического обмена. Кальций, натрий, калий, силиций, хлор тоже есть в микробных клетках. Содержатся в них и микроэлементы: молибден, кобальт, бор, марганец, цинк, медь, никель и др. Наличие микроэлементов в микробах обязательно; они стимулируют процессы роста и размножения.

Химические элементы образуют в микробных клетках различные органические вещества: белки, углеводы, липиды, витамины, которые распределяются в сухом веществе.

Белки. Это высокомолекулярные биологические полимерные соединения, образующие при гидролизе аминокислоты. Структурные компоненты вирусов, бактерий, клеток растений и животных.

Роль белков в жизни микроба важна и разнообразна: основной структурный материал всех клеточных мембран и выполняют различные функции — каталитическую, двигательную, транспортную, защитную, гормональную, запасную и др.

Белки составляют 50—80 % сухого вещества микробов. Различают два основных вида их: протеины и протеиды. Протеины, или простые белки (альбумины, глобулины, гистоны и др.), при гидролизе распадаются на аминокислоты (тирозин, лейцин, триптофан и др.). Кроме того, они могут содержать углеводный или липидный компонент. Протеиды, или сложные белки, — соединения простых белков (протеинов) с небелковыми группами, нуклеиновой кислотой, полисахаридами, жироподобными и другими веществами. Отсюда различают нуклеопротеиды, гликопротеиды, липопротеиды и др.

Нуклеиновые кислоты представляют собой высокомолекулярные биологические полимеры, построенные из мононуклеотидов. Особенно характерно для них содержание фосфора (8—10 %) и азота (15—16 %), они также содержат углерод, кислород и водород. Содержание нуклеиновых кислот в бактериальной клетке может быть от 10 до 30 % сухого вещества, что зависит от вида бактерий и питательной среды. В большинстве своем они связаны с белками (нуклеопротеиды) и сложными радикалами клеточных структур бактерии. Нуклеиновые кислоты в микробных клетках существуют в виде рибонуклеиновой (РНК) и дезоксирибонуклеиновой (ДНК) кислот. Считают, что РНК преимущественно содержится в цитоплазме бактерий, в мельчайших се зернышках — рибосомах, которые осуществляют синтез ферментов. ДНК находится в ядерном веществе бактерий. ДНК является материальным носителем наследственности всех организмов, в том числе микробов. В ее структуре записана (закодирована) генетическая информация биосинтеза белков.

Углеводы. В бактериях их содержится 12—18 % от сухого вещества. Это многоатомные спирты (сорбит, маннит, дульцит); полисахариды (гексозы, пентозы, гликоген, декстрин), моносахариды (глюкоза, глюкуроновая кислота и др.). Углеводы выполняют энергетическую роль в микробной клетке.

Липиды и липоиды. Липиды — истинные жиры, липоиды — жироподобные вещества. Ряд микробов содержат липиды в значительном количестве. У риккетсий, дрожжей, микобактерий, грибов липидов содержится до 40 %. У других групп микробов содержание липидов по сравнению с белком невелико — не более 3—7 %. Бактериальные липиды состоят из свободных жирных кислот (26—28 %), нейтральных жиров, восков и фосфолипидов. Особого внимания заслуживают фосфолипиды — сложные эфиры высших спиртов и кислот, содержащие азот и фосфор. Они входят в состав токсической фракции ряда микробов.

Липиды играют роль резервных веществ, и в ряде случаев могут быть использованы как исходные компоненты для синтеза белков. С ними связана кислотоустойчивость микобактерий. Они же существенно влияют на проницаемость клеточных мембран, формируют систему пограничных мембран, выполняющих различные функции по обеспечению метаболизма микробной клетки.

Химический состав спирохет, актиномицетов, микоплазм, риккетсий, микроскопических грибов в основном сходен с бактериями.

Ферменты бактерий

Ферменты — глобулярные белки, молекулярная масса которых колеблется от 15 кД до нескольких тысяч. Это простые и сложные белки, например, уреаза, пепсин, трипсин — простые белки, а карбоксипептидаза, амилаза, рибонуклеаза — сложные. Питание и дыхание в микробной клетке происходит с участием ферментов (энзимов), которые являются биологическими катализаторами, т. е. веществами, влияющими на скорость химических реакций, из которых слагается метаболизм микроорганизмов. Незначительное количество катализатора быстро превращает большое количество субстрата, оставаясь при этом в свободном состоянии. Например, одна часть химозина (сычужного фермента) может свернуть до 12 млн частей молока; 1 г амилазы при определенных условиях может превратить в сахар 1 т крахмала.

Ферменты вырабатываются клетками и способны действовать, даже будучи выделенными из нее, что имеет большое практическое значение. Для них характерны термолабильность и высокая специфичность действия, например, фермент лактаза гидролизует лактозу, но не действует на родственные дисахариды (мальтозу, целлобиозу).

Микробная клетка может содержать большое количество ферментов, например, у аспергилла обнаружено до 50 ферментов. Благодаря этому микроорганизмы в состоянии осуществлять одновременно ряд различных реакций в среде, где они находятся.

Принято различать экзо- и эндоферменты.

Экзоферменты не связаны со структурой протоплазмы, легко выделяются в субстрат при жизни микробной клетки (гидролитические ферменты), растворимы в питательной среде и проходят через бактериальные фильтры. Эти ферменты связаны в OGHOBHOM с процессом питания: расщепляют сложные высокомолекулярные вещества (белки, крахмал, клетчатку и др.), т. с. подготавливают питательные вещества к усвоению их микробной клеткой.

Эндоферменты прочно связаны с бактериальной клеткой и действуют только внутриклеточно, осуществляя дальнейшее разложение питательных веществ и превращение их в составные части клетки. К таким ферментам можно отнести, например, дегидрогеназы, оксидазы.

Оптимальная температура для действия ферментов 40—50 °С, для некоторых 58—60 °С; при температуре 100 °С они разрушаются. На активность их влияет и рН среды. У бактерий, растущих при кислых значениях рН (ацидофилы), максимум активности ферментов наблюдается при рН 4,8; у растущих при нейтральном и близком к нейтральному значению рН максимум активности ферментов наблюдается при рН 7,2; у бактерий, способных расти в широком диапазоне рН, реакция среды заметно не влияет на активность ферментов.

Название фермента связано с веществом, на которое он действует, с изменением окончания на «аза» или с природой катализируемой им химической реакции. На этом же основана и современная классификация их. В настоящее время насчитывается более двух тысяч ферментов. Их разделяют на шесть классов:

1. Оксидорсдуктазы — ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. Играют большую роль в процессах биологического получения энергии. К ним относятся дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), каталаза, цитохромы, ферменты, участвующие в переносе электронов водорода, кислорода и др.

2. Трансфсразы — ферменты, катализирующие перенос отдельных радикалов, частей молекул или целых атомных группировок (не водорода) от одних соединений к другим. Например, ацетилтрансферазы переносят остатки уксусной кислоты (СНзСО), а также молекул жирных кислот; фосфотрансферазы или киназы обусловливают перенос остатков фосфорной кислоты (Н2РО3). Известны многие другие трансфсразы (аминотрансферазы и т. д.)

3. Гидролазы — ферменты, катализирующие реакции расщепления и синтеза таких сложных соединений, как белки, жиры и углеводы, с участием воды. К этому классу относятся протеолитические ферменты (или пептидгидролазы), действующие на белки или пептиды; гидролазы глюкозидов, осуществляющие каталитическое расщепление углеводов и глюкозидов фрукто-фуранозидаза, ее -глюкозидаза, ее — и 3 -амилаза, 3 -галактозидаза и др.); экстеразы, катализирующие расщепление и синтез сложных эфиров (липазы, фосфатазы.).

4. Лиазы — ферменты, катализирующие отщепление от субстратов определенных химических групп с образованием двойных связей или присоединение отдельных групп или радикалов по двойным связям. Так, пируватдекарбоксилаза катализирует отщепление СО2 от пировиноградной кислоты:

К лиазам относится также фермент альдолаза, расщепляющий шестиуглеродную молекулу фруктозо-1,6-дифосфата на два трех-углеродных соединения. Альдолаза имеет большое значение к процессе обмена веществ.

5. Изомеразы — ферменты, осуществляющие превращение органических соединений в их изомеры. При изомеризации происходит внутримолекулярное перемещение атомов, атомных группировок, различных радикалов и т. п. Изомеризации подвергаются углеводы и их производные, органические кислоты, аминокислоты и т. д. Ферменты этой группы играют большую роль в ряде процессов метаболизма. К ним относятся триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза и др.

6. Лигазы — ферменты, катализирующие синтез сложных органических соединений из простых. Например, аспарагинсинтетаза осуществляет синтез амида аспарагина из аспарагиновой кислоты и аммиака с обязательным участием аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), дающей энергию для этой реакции:

Аспарагиноная кислота + NII3 + АТФ AcnapaiHH + АДФ + 11)14)4

К группе лигаз относятся также карбоксилазы, катализирующие присоединение СО2 к различным органическим кислотам. Например, фермент пируваткарбоксилаза катализирует синтез щевелево-уксусной кислоты из пировиноградной и СО2.

По классификации ферментов каждый фермент имеет шифр, включающий 4 цифры, из которых первая указывает на класс, вторая — на подкласс, третья — на подподкласс и четвертая — на порядковый номер фермента в данном подподклассе. Так, шифр 3.5.1.5 принадлежит карбамидамидогидролазе (уреазе), которую относят к третьему главному классу — гидролазам.

Скорости реакций, катализируемых ферментами, различны и зависят от количества и активности ферментов, концентрации субстрата, рН, температуры, присутствия в среде активаторов и ингибиторов.

Активность измеряют в международных единицах (ME); I ME соответствует количеству фермента, превращающему 1 мкМ (микромоль) (мг/М; 10 М) субстрата в 1 мин в стандартных условиях.

Большое число разнообразных ферментов, синтезируемых клетками микроорганизмов, позволяет использовать их в промышленном производстве для приготовления уксусной, молочной, щавелевой, лимонной кислот, молочных продуктов (сыр, ацидофилин, кумыс и пр.), в виноделии, пивоварении, силосовании. По ферментативной специфичности отдельных бактерий в лабораторных условиях можно дифференцировать их виды, разновидности.

Физиология микроорганизмов

Краткий исторический обзор возникновения и развития микробиологии.

Микробиология – относительно молодая наука, ее ис­тория насчитывает не более 300 лет. В истории микробио­логии можно выделить два периода, морфологический и физиологический. Первый связан с именем голландца Антония ван Левенгука (1632–1723), который в конце XVII в. создал первые микроскопы, увеличивающие предметы в 160-300 раз. Второй связан с именем великого француз­ского ученого Луи Пастера (1822–1895), которым были сделаны следующие открытия:

1857 – брожение, 1860 – самопроизвольное зарождение, 1865 – болезни пива и вина, 1868 – болезни шелковичных червей, 1881 – зараза и вакцина, 1885 – предохранение от бешенства.

Эти открытия послужили фундаментом дальнейшего развития микробиологической науки.

Развитие микробиологии связано и с именами выдаю­щихся русских ученых. И. И. Мечников (1845–1916) от­крыл защитные свойства организма (явление фагоцитоза), создал учение о невосприимчивости (иммунитете) организма к заразным заболеваниям. С. Н. Виноградский (1856–1953) – основоположник учения о роли микробов в плодородии почвы. Д. И. Ивановский (1864–1920) впервые обнаружил существование ультрамалых микробов-вирусов, положил начало науке по изучению фильтрующихся вирусов – вирусологии.

Изучение курса ставит задачей дать специалистам зна­ния, необходимые для практической деятельности, исходя из того, что современные методы сохранения пищевых продуктов основаны на изучении жиз­недеятельности микроорганизмов. Без знаний по микробиологии и санитарии невозможно осуществлять и совершенствовать микробиологический и санитарный контроль предприятий общественного питания, разрабатывать эффек­тивные меры по предотвращению развития и уничтоже­нию посторонней нежелательной микрофлоры, а также обеспечивать население доброкачественными продуктами питания.

1. Классификация микроорганизмов. Характеристика основных групп микроорганизмов: бактерии, плесневые грибы, дрожжи, ультрамикробы.

Микробы - это мельчайшие, преимущественно одноклеточные живые организмы, видимые только в микроскоп. Размер микроорганизмов измеряется в микрометрах - мкм (1/1000 мм) и нанометрах - нм (1/1000 мкм).

Микробы характеризуются огромным разнообразием видов, отличающихся строением, свойствами, способностью существовать в различных условиях среды. Они могут бытьодноклеточными, многоклеточными инеклеточными.

Микробы подразделяют на бактерии, вирусы и фаги, грибы, дрожжи.

БАКТЕРИИ.

Бактерии - преимущественно одноклеточные микроорганизмы размером от десятых долей микрометра, например микоплазмы, до нескольких микрометров, а у спирохет - до 500 мкм.

Различают три основные формы бактерий - шаровидные (кокки), палочковидные (бациллы и др.), извитые (вибрионы, спирохеты, спириллы) (рис. 1).

Рис. 1. Формы бактерий: 1 - микрококки; 2 - стрептококки; 3 - сардины; 4 - палочки без спор; 5 - палочки со спорами (бациллы); 6 - вибрионы; 7- спирохеты; 8 - спириллы (с жгутиками); 9 – стафилококки.

Шаровидные бактерии (кокки) имеют обычно форму шара, но могут быть немного овальной или бобовидной формы. Кокки могут располагаться поодиночке (микрококки); попарно (диплококки); в виде цепочек (стрептококки) или виноградных гроздьев (стафилококки), пакетом (сарцины). Стрептококки могут вызывать ангину и рожистое воспаление, стафилококки - различные воспалительные и гнойные процессы.

Палочковидные бактерии самые распространенные. Палочки могут быть одиночными, соединяться попарно (диплобактерии) или в цепочки (стрептобактерии). К палочковидным относятся кишечная палочка, возбудители сальмонеллеза, дизентерии, брюшного тифа, туберкулеза и др. Некоторые палочковидные бактерии обладают способностью при неблагоприятных условиях образовывать споры. Спорообразующие палочки называютбациллами. Бациллы, напоминающие по форме веретено, называютклостридиями.

Извитые бактерии могут быть в виде запятой - вибрионы, с несколькими завитками - спириллы, в виде тонкой извитой палочки - спирохеты. К вибрионам относится возбудитель холеры, а возбудитель сифилиса - спирохета.

Бактериальная клетка имеет клеточную стенку (оболочку), часто покрытую слизью. Нередко слизь образует капсулу. Содержимое клетки (цитоплазму) отделяет от оболочки клеточная мембрана. Цитоплазма представляет собой прозрачную белковую массу, находящуюся в коллоидном состоянии.

Микоплазмы - бактерии, лишенные клеточной стенки, нуждающиеся для своего развития в ростовых факторах, содержащихся в дрожжах.

Некоторые бактерии могут двигаться. Движение осуществляется с помощью жгутиков - тонких нитей разной длины, совершающих вращательные движения. Жгутики могут быть в виде одиночной длинной нити или в виде пучка, могут располагаться по всей поверхности бактерии. Жгутики есть у многих палочковидных бактерий и почти у всех изогнутых бактерий. Шаровидные бактерии, как правило, не имеют жгутиков, они неподвижны.

Размножаются бактерии делением на две части. Скорость деления может быть очень высокой (каждые 15-20 мин), при этом количество бактерий быстро возрастает. Такое быстрое деление наблюдается на пищевых продуктах и других субстратах, богатых питательными веществами.

ВИРУСЫ

Вирусы - особая группа микроорганизмов, не имеющих клеточного строения. Размеры вирусов измеряются нанометрами (8-150 нм), поэтому их можно увидеть только с помощью электронного микроскопа.

Вирусы вызывают такие распространенные болезни человека, как грипп, вирусный гепатит, корь, а также болезни животных - ящур, чуму животных и многие другие.

Вирусы бактерий называютбактериофагами , вирусы грибов -микофагами и т. п. Бактериофаги встречаются повсюду, где есть микроорганизмы. Фаги вызывают гибель микробной клетки и могут использоваться для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний.

ГРИБЫ

Грибы являются особыми растительными организмами, которые не имеют хлорофилла и не синтезируют органические вещества, а нуждаются в готовых органических веществах. Поэтому грибы развиваются на различных субстратах, содержащих питательные вещества. Некоторые грибы способны вызывать болезни растений (рак и фитофтора картофеля и др.), насекомых, животных и человека.

Клетки грибов отличаются от бактериальных наличием ядер и вакуолей и похожи на растительные клетки. Чаще всего они имеют форму нитей -гифов. Из гифов образуетсямицелий, или грибница.

Грибы могут размножаться разными путями, в том числе вегетативным путем в результате деления гиф. Большинство грибов размножаются бесполым и половым путями при помощи образования специальных клеток размножения -спор.

Обширную группу грибов представляют плесневые грибы (рис. 2). Широко распространенные в природе, они могут расти на пищевых продуктах, образуя хорошо видные налеты разной окраски. Причиной порчи продуктов часто являются мукоровые грибы, образующие пушистую белую или серую массу. Мукоровый гриб ризопус вызывает «мягкую гниль» овощей и ягод, а гриб ботритис покрывает налетом и размягчает яблоки, груши и ягоды. Возбудителями плесневения продуктов могут быть грибы из рода пениииллиум.

Отдельные виды грибов способны не только приводить к порче продуктов, но и вырабатывать токсические для человека вещества - микотоксины. К ним относятся некоторые виды грибов рода аспергиллус, рода фузариум и др.

Полезные свойства отдельных видов грибов используют в пищевой и фармацевтической промышленности и других производствах. Например, грибы рода пениииллиум применяются для получения антибиотика пенициллина и в производстве сыров (рокфора и камамбера), грибы рода аспергиллус - в производстве лимонной кислоты и многих ферментных препаратов.

Актиномицеты - микроорганизмы, имеющие признаки и бактерий, и грибов. По строению и биохимическим свойствам актиномицеты аналогичны бактериям, а по характеру размножения, способности образовывать гифы и мицелий похожи на грибы.

Рис. 2. Виды плесневых грибов: 1 - пениииллиум; 2- аспергиллус; 3 - мукор.

ДРОЖЖИ

Дрожжи - одноклеточные неподвижные микроорганизмы размером не более 10-15 мкм. Форма клетки дрожжей бывает чаще круглой или овальной, реже палочковидной, серповидной или похожей на лимон. Клетки дрожжей своим строением похожи на грибы, они также имеют ядро и вакуоли. Размножение дрожжей происходит почкованием, делением или спорами.

Дрожжи широко распространены в природе, их можно обнаружить в почве и на растениях, на пищевых продуктах и различных отходах производства, содержащих сахара. Развитие дрожжей в пищевых продуктах может приводить к их порче, вызывая брожение или закисание. Некоторые виды дрожжей обладают способностью превращать сахар в этиловый спирт и углекислый газ. Этот процесс называется спиртовым брожением и широко используется в пищевой промышленности и виноделии.

Некоторые виды дрожжей кандида вызывают заболевание человека - кандидоз.

3. Техника микроскопирования: устройство микроскопа, приготовление препаратов.

Для исследования дрожжей, бактерий и плесневых грибов применяют микроскопы, предназначенные для рассмотрения прозрачных препаратов в проходящем свете (рис. 3).

Рис. 3. Микроскоп МБИ-1: 1 - зеркало, 2 - конденсор, 3 - предметный столик, 4 - объективы, 5 - револьвер, 6 - окуляр, 7 - тубус, 8 - тубусодержатель, 9 - макрометрический винт, 10 - микрометрический винт, 11 - ножка

Оптическая часть микроскопа . Основной частью оптической системы микроскопа является объектив, увеличивающий изображение предмета. Он состоит из ряда линз, склеенных канадским бальзамом и заключенных в металлическую трубку; на трубке имеется резьба, при помощи которой объектив ввинчивается в специальное гнездо револьвера.

Изображение, даваемое объективом, рассматривают с помощью окуляра, находящегося в верхней части тубуса микроскопа. Биологические микроскопы снабжаются тремя сменными окулярами. На верхней оправе линзы окуляра указано его увеличение. Обычно окуляры дают увеличение в 7, 10 и 15 раз. Общее увеличение объекта микроскопом равно произведению увеличения окуляра на увеличение объектива = 900 раз.

Осветительное устройство располагается под столиком микроскопа и состоит из конденсора с ирис-диафрагмой и зеркала.

Механическая часть микроскопа . Эта часть состоит из штатива, тубусодержателя с револьвером, винтов для передвижения тубуса (макрометрического и микрометрического), осветительного аппарата и предметного столика микроскопа. Основными частями штатива являются нижняя подставка (ножка), придающая микроскопу устойчивость, и тубусодержатель микроскопа.

Техника микроскопирования . Прежде чем начать микроскопирование, необходимо установить правильное освещение. Для этого с микроскопа снимают окуляр и, глядя прямо в объектив, устанавливают зеркало так, чтобы источник света (лампа или окно) были видны посредине объектива. После предварительной установки света на предметный столик микроскопа кладут готовый препарат и закрепляют его зажимами. При помощи макрометрического винта опускают тубус почти до соприкосновения с покровным стеклом. Затем, глядя в окуляр, постепенно поднимают тубус до появления изображения. Для наведения резкости пользуются микрометрическим винтом.

При микроскопиравании следует держать оба глаза открытыми. Смотрят в микроскоп левым глазом.

Техника приготовления препарата для микроскопирования . Каплю исследуемой жидкости наносят на чистое предметное стекло и осторожно накрывают покровным стеклом. Если препарат готовят с плотной питательной среды, то на предметное стекло наносят капельку чистой водопроводной воды, в нее помещают исследуемую культуру и препарат накрывают покровным стеклом. Под последним не должно оставаться пузырьков воздуха, так как они мешают микроскопированию. Избыток жидкости, выступающий из-за покровного стекла, убирают фильтровальной бумагой, заранее нарезанной небольшими узкими полосками. Готовый препарат помещают на предметный столик и исследуют.

Физиология микроорганизмов

План

1. Питание микроорганизмов: сущность, назначение; понятие о плазмолизе, плазмоптисе, тургорном давлении.

1. Питание микроорганизмов: сущность, назначение; понятие о плазмолизе, плазмоптисе, тургорном давлении.

Всем микроорганизмам для осуществления процессов метаболизма, обеспечивающих синтез соединений, из которых построена клетка, а также обеспечивающих расщепление веществ для получения энергии, необходимы питательные вещества.

В качестве питательных веществ и источника энергии микроорганизмы используют различные органические и неорганические соединения.

Между микробной клеткой и внешней средой происходит постоянный интенсивный процесс обмена. Поглощение питательных веществ и выделение продуктов жизнедеятельности происходит у микроорганизмов через всю поверхность полупроницаемой оболочки. В основе механизма проникновения питательных веществ через стенку клетки лежат сложные физико-химические явления. Через полупроницаемую оболочку в тело микробов поступают вода и растворенные в ней питательные вещества. В клетке накапливается материал, необходимый для ее роста.

В тело клетки через ее оболочку не могут проникать вещества, имеющие большие размеры молекул (коллоиды, белки и др.). Они проникают в клетку только после предварительного их расщепления ферментами, выделяемыми в питательную среду.

Процесс питания микроорганизмов имеет ряд особенностей: во – первых, поступление питательных веществ происходит через всю поверхность клетки, во – вторых, микробная клетка обладает исключительной быстротой метаболических реакций, в третьих, микроорганизмы способны довольно быстро адаптироваться к изменяющимся условиям среды обитания.

Посредством питания осуществляется связь организма с внешней средой.

Концентрация питательной среды оказывает влияние на состояние клетки.

Тургор - состояние, которое возникает при оптимальной концентрации веществ в питательной среде. Тургор характеризуется внутренним гидростатическим давлением в клетке, вызывающим напряжение в клеточной стенке. В результате цитоплазма клетки плотно прижимается к цитоплазматической мембране, растягивая ее. В состоянии тургора клетки микроорганизмов нормально осуществляют процессы жизнедеятельности.

Плазмолиз - это процесс сжимания цитоплазмы клетки в результате увеличения осмотического давления в среде и обезвоживания клетки. В результате плазмолиза происходит гибель микроорганизмов. Явление плазмолиза наблюдается при консервировании продуктов с солью и сахаром. Добавление в продукты соли или сахара повышает стойкость продуктов против микробной порчи при хранении. Высокие концентрации соли вызывают плазмолиз клеток, подавляют процесс дыхания, нарушают функции клеточных мембран. При концентрации соли 7-10 % прекращается размножение многих гнилостных бактерий.

Плазмоптиз (от плазма и греч. ptisis - дробление) - набухание микробных клеток и разрушение их оболочек в гипотоническому растворе.

Плазмоптиз - явление, обратное плазмолизу. На­ступает при чрезмерно низком осмотическом давлении внешней среды, когда вследствие высокой разности осмо­тических давлений цитоплазма быстро переполняется во­дой. Это может привести к разрыву клеточной оболочки, что наблюдается, например, при помещении бактерий в дистиллированную воду.

Иногда разрываются целые группы клеток при растрескивании сочных плодов (виды родов Cerasus, Prunus и др. в период длительных дождей).

По способу питания микроорганизмы разделяют на аутотрофные и гетеротрофные.

Аутотрофы способны синтезировать из неорганических веществ (в основном углекислого газа, неорганического азота и воды) органические соединения. В качестве источника энергии для синтеза эти микробы используют световую энергию (фотосинтез) или энергию окислительных реакций (хемосинтез).